Иммунохимические методы анализа. Научная электронная библиотека монографии, изданные в издательстве российской академии естествознания

Схема тест-полоски.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) - иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет.

Сущность метода

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест-полоски в биологическую жидкость (или другой жидкий образец), она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске. Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.
Метод конкурентого ИХА , используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых".

Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

Метки, используемые в ИХА

В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:

Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мильтианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.
Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.
Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.
Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.
Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.).

Страница 2 из 3

Иммунохроматографический тест

Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости (см.рис.1). Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения.

Иммунологический метод анализа основан на реакции между антигеном и соответствующим ему антителом. Антиген - это вещество, которое чужеродное для организма человека и которое может запустить иммунную систему (защитную реакцию). Антитела - это белки, которые выделяются клетками нашего организма при внедрении в него антигена. Метод имунной хроматографии основан на особенном свойстве антител связываться с антигеном специфическим (то есть избирательным) образом. Это означает, что каждое антитело узнает и связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа в том числе и ИХА. Причем определяемым «антигеном» в данном методе анализа может служить и определяемое в биоматериале антитело к инфекционному агенту или аутоантитело, тогда остальные используемые в тесте антитела будут являться антиантителами. В ИХА- тестах используется три типа антител.

1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).

2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.

3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Принцип работы тестов на наркотики несколько отличается от других тест-систем. Устройство ИХА-полоски отличается тем, что в тест-зоне иммобилизованы искусственные антигены, способные специфически связываться со свободными антителами. Если исследуемый антиген (наркотик) НЕ присутствует в физиологической жидкости, участки связывания антител (эпитопы) остаются свободными, и они способны связываться с искусственными антигенами в тест-зоне, образуя темную полосу за счет конъюгированного красителя. Соответственно если исследуемый антиген присутстствует в жидкости, то антитела, связавшись с ним, уже не могут взаимодействовать с антигенами в тест-зоне и образования темной полосы там не происходит. Но в обоих случаях (если анализ проведен правильно) происходит связывание "окрашенных" антител со вторичными антителами в контрольной зоне и образование там темной полосы. Возможные варианты при проведении анализа: одна полоса - положительный результат, две полосы - отрицательный результат, нет полос - анализ проведен неправильно.

Основными преимуществами использования иммунохроматографических тест полосок являются:

1) Простота и удобство - позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков

2) Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль

3) Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день

4) Анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ

5) Независимость - не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача

Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ в организме человека. Экспресс-тесты отличаются высокой степенью чувствительности и точности, обнаруживая более 100 видов заболеваний, включающих такие распространённые болезни как туберкулёз, сифилис, гонорею, хламидиоз, различные виды вирусных гепатитов, и др., а также всю гамму применяемых наркотических веществ при высокой достоверности определения. Важным преимуществом данного вида тестов является их применение в диагностике in vitro, не требующей непосредственного присутствия обследуемого пациента.

Однако иммунохроматографические тест-полоски не лишены недостатков. Касается это надежности, чувствительности и экономичности тестов. Надежность и чувствительность зависит, во-первых, от качества используемых в тесте моноклональных антител и, во-вторых, от концентрации антигена в биоматериале. Качество моноклональных антител зависит от способов их получения, очистки и фиксации на носителе. Концентрация антигена – от стадии заболевания и количества биоматериала. Количество биоматериала особенно важно при использовании цельной крови. При этом существенную роль играет гематокрит, т.е. соотношение плазмы и форменных элементов. При высоком гематокрите снижается количество плазмы с антигеном, мигрирующей вдоль полоски. Температура, от которой зависит скорость взаимодействие антитела с антигеном, важна только для времени постановки теста. Понятно, что использовать полоски при температуре ниже точки замерзания воды, составляющей основную часть биоматериала, не имеет смысла.

Вызывает большие сомнения экономичность использования экспресс-тестов в бюджетных медицинских организациях, которые занимаются массовой диспансеризацией населения и которым как раз-то удобны и необходимы комплексные стрип-системы из тест-полосок для скринингового выявления различных заболеваний. Обусловлено это низкой стоимостью анализа по бюджетным расценкам. При этом себестоимость тест-полоски в некоторых случаях в 10 раз превосходит оплату анализа.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины. Индикация образующегося комплекса «антиген-антитело» может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флюоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз. Иммунохимические методы анализа можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринной и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии - для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Иммуноферментный метод
Иммуноферментный анализ - вид иммунохимического анализа, основанный на высокоспецифической иммунологической реакции антигена с соответствующим антителом с образованием иммунного комплекса, для выявления которого используют в качестве метки фермент или ферментзависимое вещество.

ПРИНЦИП МЕТОДА
В основе метода иммуноферментного анализа лежит оценка результатов иммунной реакции антигена с антителом.

Полученный комплекс определяется следующим образом: в реакционную смесь вводят конъюгат, который включает ферментную метку, а также добавляют специальный хромогенный субстрат. Фермент, взаимодействуя с субстратом, изменяет его окраску. Учет результатов проводят фотометрически.

ХАРАКТЕРИСТИКИ И НАЗНАЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ
В современной лаборатории исследования методом иммуноферментного анализа проводят с использованием коммерческих тест-систем. Основными характеристиками тестов являются чувствительность и специфичность. Под чувствителъностъю понимается процент выявленных тест-системой позитивных образцов из массива положительных образцов, где все результаты были подтверждены, например сероконверсионные панели позитивных контрольных сывороток. Таким образом, чувствительность тест-системы является показателем вероятности появления ложноотрицательного результата. Ложноотрицательный результат - отрицательный результат, полученный в данной тест-системе для образца, являющегося на самом деле положительным.

Под специфигностью понимается процент выявленных негативных образцов из панели негативных контрольных сывороток. Таким образом, специфичностью тест-системы является показатель вероятности появления ложноположительного результата, т.

е. положительный в данной тест-системе результат, полученный для образца, являющегося на самом деле отрицательным.

Кроме подразделения тест-систем по исследуемому показателю (инфекционной диагностике, исследованию эндокринной системы, определению онкомаркеров и др.), тесты делятся на группы по своему целевому назначению.

Так, например, применительно к диагностике инфекционных заболеваний тест-системы подразделяются:
на скрининговые, призванные при первичном обследовании выявлять инфицированных;
диагностигеские, используемые при обследовании больных, у которых подозревается или имеется определенная инфекция;
подтверждающие, используемые как дополнительные после получения положительных результатов скринингового или диагностического теста;
тесты для мониторинга (оценка эффективности проводимой терапии).

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
Неправильное выполнение этих процедур является одним из основных источников (до 20%) ошибок на преаналитическом этапе, поэтому процедура взятия крови и других образцов в инструкции для персонала должна быть описана всесторонне, включая идентификацию образца, детальное описание технологии и биологическую безопасность.

Условия подготовки пациента удобно отражать в виде памятки в направлении на анализ, где следует указать ошибки и рекомендации при взятии венозной крови - основного материала для ИФА-исследований.

В инструкции по качеству проведения преаналитического этапа необходимо четко прописать условия взятия биологического материала для исследования. Следует учитывать, что на результаты исследования влияет набор биологических факторов, которые описывают состояние организма.

Беременность
Трактуя результаты лабораторных исследований у беременных, необходимо учитывать срок беременности в момент взятия пробы. При физиологической беременности средний объем плазмы возрастает примерно от 2600 до 3900 мл, причем в первые 10 нед прирост может быть незначительным, а затем происходит нарастающее увеличение объема к 35-й неделе, когда достигается указанный уровень.

Объем мочи также может физиологически увеличиваться до 25% в III триместре. В последнем триместре наблюдается 50% физиологическое повышение скорости клубочковой фильтрации. Хорошо известные свойственные беременности изменения выработки и концентрации в плазме половых гормонов сопровождаются изменениями различных аналитов, например тиреоидных гормонов.

Влияние суточных колебаний
Некоторые компоненты подвержены влиянию суточных колебаний. Так, содержание кортизола возрастает в течение дня и снижается ночью. Циркадный ритм может изменяться под влиянием индивидуальных ритмов - еды, сна, физической активности. Эти влияния не следует путать с действительно циркадными колебаниями.

Влияние фазы менструального цикла
Статистически значимые изменения концентрации могут быть вызваны колеба¬ниями гормонального фона при менструации. Так, концентрация альдостерона в плазме определяется в два раза выше перед овуляцией, чем в фолликулярной фазе. Подобным образом ренин может проявить предовуляторное повышение.

Употребление лекарств
При подготовке обследуемых к биохимическим исследованиям приняты следующие подходы:
лекарства, мешающие определению компонентов, исключают до взятия биоматериала, если их дают не по жизненным показаниям;
утренний прием лекарств проводят только после взятия биоматериала;
взятие крови с диагностической целью проводят перед инфузией лекарств и растворов.

Загрязнение лабораторных проб инфузионньши растворами является самой обычной и часто встречаемой формой преаналитической интерференции в больницах. Рекомендуют информировать лабораторию, когда и какое вливание было проведено пациенту и когда была взята проба крови. Пробу крови никогда не следует брать из сосуда, расположенного проксимально месту инфузии. Пробы следует брать из вены другой руки, в которую не проводили вливание.

Диета
После приема пищи содержание отдельных продуктов обмена в крови может повышаться или подвергаться изменениям в результате постабсорбционных гормональных эффектов. Определение других аналитов может затрудняться вследствие мутности, вызванной хиломикронемией в послеобеденных пробах крови. Для того чтобы исключить влияние данных факторов, рекомендуют соблюдать 8-12-часовой период голодания перед взятием проб для лабораторного исследования.

Психический стресс и физическая активность
Степень влияния психического стресса (страха перед взятием крови, предо-перационного стресса и т. д.) на лабораторные результаты часто недооценивается. Между тем под его влиянием может наблюдаться увеличение секреции гормонов (альдостерона, ангиотензина, катехоламинов, кортизола, пролактина, ренина, соматотропина, вазопрессина), а также повышение других показателей (альбумина, фибриногена, глюкозы, инсулина, лактата и холестерина). Состояние физической активности обследуемого оказывает большое влияние на результаты. При длительном строгом постельном режиме и ограничении физической активности повышается экскреция с мочой норадреналина, кальция, хлора, фосфатов, аммиака, повышается активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Таким образом, для объективного лабораторного анализа необходимо добиваться стандартизации подготовки пациента перед взятием клинического материала.

ВЗЯТИЕ ПРОБ У ПАЦИЕНТА
Рекомендации по условиям взятия крови и других биожидкостей для лабораторного исследования методом иммуноферментного анализа следующие.
1. По возможности пробы следует брать между 7 и 9 ч утра.
2. Взятие проб следует выполнять через 8-12 ч после последнего приема пищи.
3. Взятие проб следует выполнять до диагностических и лечебных процедур, способных оказать влияние на результаты теста.
4. В случае проведения лекарственного мониторинга следует учитывать пик концентрации после введения лекарственного препарата и фазу устойчивого состояния перед введением следующей дозы препарата.
5. Период воздержания от приема алкоголя должен быть не менее 24 ч до взятия биожидкости.
6. Кровь для исследования на вещества, концентрация которых в крови изменяется циклически, следует забирать в строгом соответствии с физиологическими циклами. Например, оценка уровня фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона привязывается ко дню менструального цикла.
7. Для исключения влияния изменения положения тела обследуемый должен находиться в покое, сидеть или лежать не менее 5 мин.
8. При динамическом наблюдении за пациентом взятие материала нужно проводить в идентичном положении тела.
9. Сдавление сосудов (вен) при наложении жгута (манжеты) при взятии крови должно быть минимальным и не превышать 1 мин.
10. Всегда следует отмечать точное время взятия пробы в соответствующих документах.

ТРАНСПОРТИРОВКА ОБРАЗЦОВ. ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ И ТЕМПЕРАТУРЫ
Полученная кровь должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Согласно рекомендациям практически всех компаний - производителей иммуноферментных тест-систем, необходимо не позже 1 ч после взятия крови отобрать из нее сыворотку.

Рекомендации по условиям хранения и транспортировке биологического материала для иммунологических исследований следующие.
1. Быстрая транспортировка и короткий срок хранения улучшают достоверность результатов лабораторных исследований. Следует избегать хранения цельной крови. Пробы крови должны быть доставлены в лабораторию в течение 45 мин после взятия крови, чтобы центрифугирование и разделение пробы было выполнено в течение 1 ч.
2. Образцы и пробы сохраняются тем лучше, чем ниже температура их хранения.
3. Образцы и пробы всегда следует хранить в закрытых сосудах (испарение!). Испарение/сублимация приводят к заметному повышению концентрации/ активности всех нелетучих компонентов. Это особенно выражено, когда объем пробы относительно небольшой, а площадь поверхности относительно велика. Опасность испарения существует и в холодильниках (конденсация влаги на охлаждающих элементах).
4. Проблемы хранения уменьшаются при использовании одноразовых систем для сбора проб.
5. Разделительные элементы (например, разделительные гели) улучшают выход сыворотки/плазмы и позволяют оставлять сыворотку в первичных пробирках над сгустком.
6. Избегают встряхивания сосудов с пробами (системы пневматической доставки пробирок!): риск гемолиза увеличивается.
7. Всегда хранят сосуды с кровью в вертикальном положении. Избегают воздействия света.
8. Маркируют инфицированный материал и обращаются с ним с особой осторожностью.

СТАНДАРТНАЯ КОМПЛЕКТАЦИЯ ИФА-НАБОРА
ИФА-набор, как правило, включает все необходимые для анализа реагенты, обычно на 96 определений. В набор, как правило, входят следующие реагенты.
Стандарты (если это набор для количественного иммуноферментного анализа), 5-7 растворов с различными концентрациями определяемого аналита.
Конъюгат (готовый раствор или концентрат), содержащий антитела или антиген с ферментной меткой.
96-луночный микропланшет с иммуносорбентом, упакованный в алюминиевую фольгу с осушителем.
Концентрат промывочного буфера.
Субстратно-хромогенный реактив - монореагент или состоящий из двух компонентов: раствора А, обычно содержащего тетраметилбензидин в буфере, и раствора В - перекиси водорода в буфере.
Стоп-раствор, чаще всего это раствор соляной кислоты.
Контрольная сыворотка (одна или несколько). В некоторые наборы реагентов контрольные сыворотки не входят, их заказывают отдельно. В набор могут дополнительно входить реагенты для разведения образцов, конъюгата, субстрата, стандарта.

ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В МИКРОПЛАНШЕТНОМ ФОРМАТЕ
Объектом исследования в формате иммуноферментного анализа могут быть как антигены, так и антитела. В схемах иммуноферментного анализа для определения антигенов в качестве последнего могут выступать антиген возбудителя инфекции, регуляторный белок или гормон, онкомаркер или другое соединение, обладающее иммуногенной активностью, которое должно быть определено в образце. Существует множество модификаций метода иммуноферментного анализа, но наибольшее распространение получил гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ в микропланшетном формате. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистиролового микропланшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела. Антиген или антитело, иммобилизованное на поверхности твердого носителя, принято называть иммуносорбентом. В ходе высокоспецифической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые также оказываются фиксированными на твердой фазе. Субстанции, не участвующие в реакции, и избыточное количество реагентов удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции.

В настоящее время получили распространение тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител. В этом случае стандарты, контроли и пробы пациентов сначала добавляют в микроячейки, покрытые стрептавидином. Стрептавидин отдаляет реакцию от поверхности плашки, создавая эффект взаимодействия «антиген-антитело» в объеме, а не на поверхности, тем самым увеличивая чувствительность диагностической системы. Затем добавляют биотинилированные антитела (смесь высокоочищенных специфических моноклональных антител к различным эпитопам), меченные ферментом антитела (конъюгат), реагенты перемешивают. Результатом реакции между различными антителами и определяемым антигеном становится образование «сэндвич»-комплекса, который связывается со стрептавидином в ячейках. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. После инкубации с субстратным раствором и остановки реакции фотометрически определяют оптическую плотность растворов в лунках. Тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител являются тестами II поколения, обладают повышенной чувствительностью.

ОСОБЕННОСТИ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА
Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний.

Как правило, для диагностики инфекций используют два вида серологических реакций:
обнаружение патогенспецифических антител в сыворотке крови обследуемого;
установление родовой и видовой принадлежности микроорганизма или вируса.

В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками. В тест-системах для качественного анализа результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности. Для обозначения оптической плотности могут быть использованы другие термины - «Cut-off» или «пороговое значение оптической плотности». Формулу для расчета оптической плотности указывают в инструкции к тест-системе. В расчете Cut-off могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца - контроля уровня среза. Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, то образец считается положительным на специфические антитела.

Очень часто в расчетах необходимо учитывать серую зону. Серая зона - это диапазон концентраций специфических антител, в который с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы. Границу серой зоны указывают в инструкции к тест-системе, как правило, это 10% пороговой величины. Результаты анализа, попавшие в серую зону, не могут быть однозначно интерпретированы, для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сывороткой, полученной через 1-2 нед.

Для контроля эффективности лечения важно использовать тест-системы, которые позволяют получать результаты в полуколичественном или количественном вариантах. Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off.

Образцы рассматриваются как:
положительные, если отношение более 1,1;
сомнительные, если ±10% Cut-off,
отрицательные, если отношение менее 0,9.

Радиоиммунный анализ
Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Для метки антител или антигенов чаще всего используют изотоп йода 1251, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Для радиоиммунного анализа выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Радиоиммунный анализ обладает высокими чувствительностью и специфичностью. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Популярность реакции иммунофлюорисценции объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. В настоящее время в этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом. Для уменьшения неспецифического свечения фона применяют обработку мазка бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином или голубым Эванса.

Учет результатов реакции осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливают набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или синефиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
Наибольшее распространение получили наборы, основанные на прямой реакции иммунофлюоресценции, однако имеются тест-системы, где используется реакция непрямой иммунофлюоресценции.

Если прямую реакцию иммунофлюорисценции можно использовать только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для серодиагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком реакции иммунофлюорисценции является ее субъективность. Классическими критериями специфичности этой реакции являются:
характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
периферический характер свечения объекта;
цвет флюоресценции;
интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонад, гарднерелл, клеток, пораженных вирусами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же время элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Оставшихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала, проводящего исследования.

В современной медицинской практике с каждым годом возрастает роль лабораторной диагностики как основного инструмента постановки диагноза и мониторинга терапии. Одним из бурно развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ.

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (ИХА) — это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования.ИХА — сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.

Иммунологический метод анализа основан на реакции между антигеном и соответствующим ему антителом. Антиген — это вещество, которое чужеродное для организма человека и которое может запустить иммунную систему (защитную реакцию). Антитела — это белки, которые выделяются клетками нашего организма при внедрении в него антигена. Метод имунной хроматографии основан на особенном свойстве антител связываться с антигеном специфическим (то есть избирательным) образом. Это означает, что каждое антитело узнает и связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа в том числе и ИХА. Причем определяемым “антигеном” в данном методе анализа может служить и определяемое в биоматериале антитело к инфекционному агенту или аутоантитело, тогда остальные используемые в тесте антитела будут являться антиантителами. В ИХА- тестах используется три типа антител.

Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные («сшитые») с коллоидным золотом — красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).
Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.
Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Принцип работы тестов на наркотики несколько отличается от других тест-систем. Устройство ИХА-полоски отличается тем, что в тест-зоне иммобилизованы искусственные антигены, способные специфически связываться со свободными антителами. Если исследуемый антиген (наркотик) НЕ присутствует в физиологической жидкости, участки связывания антител (эпитопы) остаются свободными, и они способны связываться с искусственными антигенами в тест-зоне, образуя темную полосу за счет конъюгированного красителя. Соответственно если исследуемый антиген присутстствует в жидкости, то антитела, связавшись с ним, уже не могут взаимодействовать с антигенами в тест-зоне и образования темной полосы там не происходит. Но в обоих случаях (если анализ проведен правильно) происходит связывание «окрашенных» антител со вторичными антителами в контрольной зоне и образование там темной полосы. Возможные варианты при проведении анализа: одна полоса — положительный результат, две полосы — отрицательный результат, нет полос — анализ проведен неправильно.

Основными преимуществами использования иммунохроматографических тест полосок являются:

1. Простота и удобство — позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков
2. Надежность — достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль
3. Экономичность — минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день
4. Анонимность — что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ
5. Независимость — не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача

Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ в организме человека. Экспресс-тесты отличаются высокой степенью чувствительности и точности, обнаруживая более 100 видов заболеваний, включающих такие распространённые болезни как туберкулёз, сифилис, хламидиоз, различные виды вирусных гепатитов, и др., а также всю гамму применяемых наркотических веществ при высокой достоверности определения. Важным преимуществом данного вида тестов является их применение в диагностике in vitro, не требующей непосредственного присутствия обследуемого пациента.

Список литературы.

Wennig R, Moeller MR, Haguenoer JM et al. (1998) Development and evaluation of immunochromatographic rapid tests for screening of cannabinoids, cocaine, and opiates in urine // J. Anal. Toxicol. — V.22 — P.148-155
Coons, S.J. A look at the purchase and use of home pregnancy-test kits. Am.Pharm. NS29:46-48, 1989.
Bastian, L.A., Nanda, K., Hasselblad, V., and Simel, D.L. Diagnostic efficiency of home pregnancy test kits. A meta-analysis. Arch.Fam.Med. 7:465-469, 1998.
Latman, N.S. and Bruot, B.C. Evaluation of home pregnancy test kits. Biomed.Instrum.Technol. 23:144-149, 1989.
Hicks, J.M. and Iosefsohn, M. Reliability of home pregnancy-test kits in the hands of laypersons . N.Engl.J.Med. 320:320-321, 1989.
Torlesse, H., Wurie, I.M., and Hodges, M. The use of immunochromatography test cards in the diagnosis of hepatitis B surface antigen among pregnant women in West Africa. Br.J.Biomed.Sci. 54:256-259, 1997.
Sato, K., Ichiyama, S., Iinuma, Y., Nada, T., Shimokata, K., and Nakashima, N. Evaluation of immunochromatographic assay systems for rapid detection of hepatitis B surface antigen and antibody, Dainascreen HBsAg and Dainascreen Ausab. J.Clin.Microbiol. 34:1420—1422, 1996.
Lein, M., Jung, K., Schnorr, D., Henke, W., Brux, B., and Loening, S.A. Rapid screening of PSA: evaluation of an immunochemical membrane strip test . Clin.Chem. 41:1545—1547, 1995.
Anderson, J.C., Cheng, E., Roeske, M., Marchildon, P., Peacock, J., and Shaw, R.D. Detection of serum antibodies to Helicobacter pylori by an immunochromatographic method. Am.J.Gastroenterol. 92:1135—1139, 1997.
Schrier, W.H., Schoengold, R.J., Baker, J.T., Norell, J.L., Jaseph, C.L., Okin, Y., Doe, J.Y., and Chandler, H. Development of FlexSure HP--an immunochromatographic method to detect antibodies against Helicobacter pylori. Clin.Chem. 44:293-298, 1998.
Cognein, P., Costa, A., and Giacosa, A. Serodiagnosis of Helicobacter pylori: evaluation of a rapid, miniaturized immunochromatographic test. Eur.J.Cancer.Prev. 3:457-463, 1994.
Shirin, H., Bruck, R., Kenet, G., Krepel, Z., Wardi, Y., Reif, S., Zaidel, L., Geva, D., Avni, Y., and Halpern, Z. Evaluation of a new immunochromatographic test for Helicobacter pylori IgG antibodies in elderly symptomatic patients . J.Gastroenterol. 34:7-10, 1999.
Kagen, L. J. 1973 Myoglobin: Biochemical, physiological and clinical aspects. New York and London Colombian University Press.
Drexel, H. et al. 1983 Myoglobinaemia in the early diagnosis of acute myocradial infarction. Am. Heart J. 105: 642-651.
McComb, J. M. et al. 1983 Myoglobin in the very early phase of acute myocardial infaretion. Ann Clin. Biochem, 22:152-155.
Grenardier, E., Keidar, S., Kahana, L., Alpan, G., Marmur, A., Palant, A. 1983 The roles of serum myoclobin, total CPK, and CK-MB isoenzyme in the acute phase of myocardial infarction. Am. Heart J. 105:408-416.
Ellis A. K., Saran, B.R. 1989 Kinetics of myoolobin release and prediction of myocardial myoglobin depletion after coronary artery reperfusion. Circulation 80: 676-682.
McComb, J.M. et al. 1984 Myoglobin and creatine kinase in acute myocardial infarction. Br. Heart J. 51:189-194.
Struyf, F., Lemmens, A., Valadas, E., Verhaegen, J., and Van Ranst, M. Usefulness of immunochromatographic detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis as an adjunct to auramine staining for rapid diagnosis of tuberculosis in a low-prevalence setting. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18:740-742, 1999.
Abe, C., Hirano, K., and Tomiyama, T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies. J.Clin.Microbiol. 37:3693—3697, 1999.
Edmund C. Tramont. Traponema pallidum (Syphilis). In Mandell, Douglas and Bennett"s Principles and Practice of infectious Diseases. G.L. Mandell, J.E. Bennett, P. Dolin, eds. Churchill Livingston New York, 1995.
Steven J. Norris and Sandra A larsen, Traponema and Other Host-Associated Spirochemetes in Manual of Clinical Microbiology. P. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yoken, eds, ASM Press , Washington D.C. 1995.
Larsen, S.A., E.F. Hunter, & S.J. Draus (ed.) 1990. A Manual of Tests for Syphilis, 8th ed. American Public Health Association, Washington D.C.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске. Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.
Метод конкурентого ИХА , используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.